实验三　五日生化需氧量的测定——碘量法

一、原理

生化需氧量是指在规定条件下，微生物分解存在于水中的某些可氧化物质，主要是有机物质所进行的生物化学过程中消耗溶解氧的量。分别测定水样培养前的溶解氧含量和在（20±1）℃下培养五天后的溶解氧含量，二者之差即为五日生化过程所消耗的氧量（BOD5）。

对于某些地面水及大多数工业废水、生活污水，因含较多的有机物，需要稀释后再培养测定，以降低其浓度，保证降解过程在有足够溶解氧的条件下进行。其具体水样稀释倍数可借助于高锰酸钾指数或化学需氧量（CODCr）推算。

对于不含或少含微生物的工业废水，在测定BOD5时应进行接种，以引入能分解废水中有机物的微生物。当废水中存在有被一般生活污水中的微生物以正常速度降低的有机物或含有剧毒物质时，应接种经过驯化的微生物。

二、仪器与试剂

①恒温培养箱。

②5～20L细口玻璃瓶。

③1000～2000mL量筒。

④玻璃搅棒：棒长应比所用量筒高度长20cm。在棒的底端固定一个直径比量筒直径略小，并带有几个小孔的硬橡胶板。

⑤溶解氧瓶：200～300mL，带有磨口玻璃塞并具有供水封用的钟形口。

⑥虹吸管：供分取水样和添加稀释水用。

⑦磷酸盐缓冲溶液：将8.5g磷酸二氢钾（KH2PO4）、21.75g磷酸氢二钾（K2HPO4）、33.4g磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）和1.7g氯化铵（NH4Cl）溶于水中，稀释至1000mL。此溶液的pH值应为7.2。

⑧硫酸镁溶液：将22.5g硫酸镁（MgSO4·7H2O）溶于水中，稀释至1000mL。

⑨氯化钙溶液：将27.5g无水氯化钙溶于水，稀释至1000mL。

⑩氯化铁溶液：将0.25g氯化铁（FeCl3·6H2O）溶于水，稀释至1000mL。

盐酸溶液（0.5mol/L）：将40mL（ρ=1.18g/mL）盐酸溶于水，稀释至100mL。

氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：将20g氢氧化钠溶于水，稀释至1000mL。

亚硫酸钠溶液（1/2Na2SO3=0.025mol/L）：将1.575g亚硫酸钠溶于水，稀释至1000mL。此溶液不稳定，需每天配制。

葡萄糖-谷氨酸标准溶液：将葡萄糖（C6H12O6）和谷氨酸（HOOCCH2—CH2CHNH2COOH）在103℃干燥1h后，各称取150mg溶于水中，移入1000mL容量瓶内并稀释至刻度，混合均匀。此标准溶液临用前配制。

稀释水：在5～20L玻璃瓶内装入一定量的水，控制水温在20℃左右。然后用无油空气压缩机或薄膜泵，将此水曝气2～8h，使水中的溶解氧接近于饱和，也可以鼓入适量纯氧。瓶口盖以两层经洗涤晾干的纱布，置于20℃培养箱中放置数小时，使水中溶解氧含量达8mg/L左右。临用前于每升水中加入氯化钙溶液、氯化铁溶液、硫酸镁溶液、磷酸盐缓冲溶液各1mL，并混合均匀。

稀释水的pH值应为7.2，其BOD5应小于0.2mg/L。

接种液：可选用以下任一方法，以获得可用的接种液。

a.城市污水，一般采用生活污水，在室温下放置一昼夜，取上清液供用。

b.表层土壤浸出液，取100g花园土壤或植物生长土壤，加入1L水，混合并静置10min，取上清液供用。

c.用含城市污水的河水或湖水。

d.污水处理厂的出水。

e.当分析含有难以降解物质的废水时，在排污口下游3～8km处取水样作为废水的驯化接种液。如无此种水源，可取中和或经适当稀释后的废水进行连续曝气，每天加入少量该种废水，同时加入适量表层土壤或生活污水，使能适应该种废水的微生物大量繁殖。当水中出现大量絮状物，或检查其化学需氧量的降低值出现突变时，表明适用的微生物已进行繁殖，可用作接种液。一般驯化过程需要3～8d。

接种稀释水：取适量接种液，加入稀释水中，混匀。每升稀释水中接种液加入量为：生活污水1～10mL；表层土壤浸出液20～30mL；河水、湖水10～100mL。

接种稀释水的pH值应为7.2，BOD5值以在0.3～1.0mg/L之间为宜。接种稀释水配制后应立即使用。

三、分析步骤

1.水样的预处理

①水样的pH值若超出6.5～7.5范围时，可用盐酸或氢氧化钠稀溶液调节pH值至近于7，但用量不要超过水样体积的0.5％。若水样的酸度或碱度很高，可改用高浓度的碱或酸液进行中和。

②水样中含有铜、铅、锌、镉、铬、砷、氰等有毒物质时，可使用经驯化的微生物接种液的稀释水进行稀释，或增大稀释倍数，以减小毒物的浓度。

③含有少量游离氯的水样，一般放置1～2h，游离氯即可消失。对于游离氯在短时间内不能消散的水样，可加入亚硫酸钠溶液除去。其加入量的计算方法是：取中和好的水样100mL，加入1+1乙酸10mL、100g/L碘化钾溶液1mL，混匀。以淀粉溶液为指示剂，用亚硫酸钠标准液滴定游离碘。根据亚硫酸钠标准溶液消耗的体积及其浓度，计算水样中所需加入亚硫酸钠溶液的量。

④从水温较低的水域中采集的水样，可能含有过饱和溶解氧，此时应将水样迅速升温至20℃左右，充分振摇，以赶出过饱和的溶解氧。

从水温较高的水域或废水排放口取得的水样，则应迅速冷却至20℃左右，充分振摇，使与空气中氧分压接近平衡。

2.水样的测定

（1）不经稀释水样的测定　溶解氧含量较高、有机物含量较少的地面水，可不经稀释，而直接以虹吸法将约20℃的混匀水样转移至两个溶解氧瓶内，转移过程中应注意不使其产生气泡。以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样，加塞水封。

立即测定其中一瓶溶解氧。将另一瓶放入培养箱中，在（20±1）℃培养5d后。测其溶解氧。

（2）需经稀释水样的测定　稀释倍数的确定：地面水可由测得的高锰酸盐指数乘以适当的系数，按表2-2求出稀释倍数。

工业废水的系数可由重铬酸钾法测得的COD值确定。通常需作三个稀释比，即使用稀释水时，由COD值分别乘以系数0.075、0.15、0.225，即获得三个稀释倍数；使用接种稀释水时，则分别乘以0.075、0.15和0.25，获得三个稀释倍数。

稀释倍数确定后按下法之一测定水样。

①一般稀释法。按照选定的稀释比例，用虹吸法沿筒壁先引入稀释水（或接种稀释水）于1000mL量筒中，加入需要量的均匀水样，再引入稀释水（或接种稀释水）至800mL，用带胶板的玻璃棒小心上下搅匀。搅拌时勿使搅棒的胶板露出水面，防止产生气泡。

按不经稀释水样的测定步骤进行装瓶，测定当天溶解氧和培养5d后的溶解氧含量。

另取两个溶解氧瓶，用虹吸法装满稀释水（或接种稀释水）作为空白，分别测定5d前、后的溶解氧含量。

②直接稀释法。直接稀释法是在溶解氧瓶内直接稀释。在已知两个容积相同（其差小于1mL）的溶解氧瓶内，用虹吸法加入部分稀释水（或接种稀释水），再加入根据瓶容积和稀释比例计算出的水样量，然后引入稀释水（或接种稀释水）至刚好充满，加塞，勿留气泡于瓶内。其余操作与上述稀释法相同。

在BOD5测定中，一般应用叠氮化钠改良法测定溶解氧。如遇干扰物质，应根据具体情况采用其他测定法。溶解氧的测定方法附后。

四、结果计算

1.不经稀释直接培养的水样

BOD5（mg/L）=c1-c2

式中　c1——水样在培养前的溶解氧浓度，mg/L；

c2——水样5d培养后剩余溶解氧浓度，mg/L。

2.经稀释后培养的水样

式中　——稀释水（或接种稀释水）在培养前的溶解氧浓度，mg/L；

——稀释水（或接种稀释水）在培养后的溶解氧浓度，mg/L；

f1——稀释水（或接种稀释水）在培养液中所占比例；

f2——水样在培养液中所占比例。

五、附注

①测定一般水样的BOD5时，硝化作用很不明显或根本不发生。但对于生物处理池出水，则含有大量硝化细菌。因此，在测定BOD5时也包括了部分含氮化合物的需氧量。对于这种水样，如只需测定有机物的需氧量，应加入硝化抑制剂，如丙烯基硫脲（ATU，C4H8N2S）等。

②在两个或三个稀释比的样品中，凡消耗溶解氧大于2mg/L和剩余溶解氧大于1mg/L都有效，计算结果时应取平均值。

③为检查稀释水和接种液的质量，以及化验人员的操作技术，可将20mL葡萄糖-谷氨酸标准溶液用接种稀释水稀释至1000mL，测其BOD5，其结果应在180～230mg/L之间。否则，应检查接种液、稀释水或操作技术是否存在问题。

六、思考题

①测定水样中BOD5时，水样的pH值应控制在什么范围？如何调节？

②水样中有毒、有害物质如何消除及处理？

附　水中溶解氧的测定——碘量法

一、原理

根据水中的溶解氧使氢氧化锰在碱性溶液中氧化的程度间接测定，即在水样中加入硫酸锰及碱性碘化钾溶液，使生成氢氧化锰沉淀，在碱性溶液中，氢氧化锰极不稳定，很快被溶解氧氧化生成棕色锰酸锰沉淀。

MnSO4+2NaOH→Mn（OH）2↓+Na2SO4

2Mn（OH）2+O2→2H2MnO3↓

H2MnO3+Mn（OH）2→MnMnO3↓+2H2O

加入浓硫酸，使已经固定的溶解氧（以MnMnO3形式存在）将溶液中所加入的碘化钾氧化而析出碘，用硫代硫酸钠标准溶液滴定，以计算水中溶解氧的含量。

2KI+MnMnO3+3H2SO4→2MnSO4+K2SO4+I2+3H2O

I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI

二、试剂配制

①氯化锰溶液：称取80g二氯化锰（MnCl2·4H2O）溶于蒸馏水中，稀释至100mL。

②碱性碘化钾溶液：溶解40g氢氧化钠于少量蒸馏水中，另溶解20g分析纯碘化钾于少量蒸馏水中，将两溶液合并，稀释至100mL。溶液保存于棕色瓶中。

以上两种试剂，供采集测定溶解氧水样时使用。

③0.01mol/L硫代硫酸钠溶液：称取2.5g硫代硫酸钠于煮沸放冷的蒸馏水中，加入0.2g无水碳酸钠，稀释至1升，贮于棕色瓶中，其准确浓度用重铬酸钾标准溶液标定，手续如下：

取K2Cr2O7=0.01mol/L重铬酸钾标准溶液：（称取0.4903g在110℃烘干2h的分析纯重铬酸钾溶于蒸馏水中，转入1L容量瓶中，稀释至刻度）20mL碘瓶（带磨口塞的锥形瓶）中，加30mL蒸馏水、6mol/L硫酸溶液5mL、1g固体碘化钾，于暗处放置5min，用硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色，加1mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失（终点显三价铬离子的绿色）。计算出硫代硫酸钠溶液的准确浓度。

④10g/L淀粉溶液：称取可溶性淀粉1g于200mL烧杯中，加入少量蒸馏水，用玻璃棒调成糊状后，加入煮沸的蒸馏水约100mL。

三、分析步骤

①取专供测定溶解氧的水样（体积已知，否则应测量其体积），将上层清液用虹吸法吸去。

②加入100g/L碘化钾溶液5mL，再沿瓶壁加入浓硫酸1mL，塞好水样瓶，摇匀，待沉淀溶解后，立即用0.01mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加入1mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失。

四、结果计算

式中　N——硫代硫酸钠溶液的浓度；

V——滴定所消耗的硫代硫酸钠溶液的体积，mL；

V1——水样瓶的容积，mL；

V2——采样时加入各种试剂的总体积，mL；

7.9997——O2的摩尔质量。

五、附注

①若水样中含有亚硝酸盐，在酸性介质中也能将碘离子氧化析出碘而干扰测定，此时可在加浓硫酸溶解沉淀物之前在水样瓶中加数滴5％叠氮化钠（NaN3）溶液，以消除亚硝酸盐的干扰。

②水样中三价铁离子存在时，也会将碘离子氧化析出碘而干扰测定，可用磷酸代替硫酸酸化，以掩蔽铁离子而消除干扰。

③溶解于水中的氧称为溶解氧，其溶解量与水的矿化度、埋藏深度、温度、大气压力及空气中的氧分压有关，如15℃、一个大气压下每升淡水可溶解10mg氧，而海水中溶解氧的含量约为淡水的80％。当水体受污染时，由于污染物质被氧化耗氧，水中所含溶解氧逐渐减少，当氧化作用进行得很快而水体不能从空气中吸收足够的氧来补充氧的消耗时，厌氧细菌便繁殖并活跃起来，致使有机污染发生腐败，水体发生臭味。溶解氧的测定对水体自净作用的研究有极重要的关系。溶解氧对于水生动物的生存有密切的关系，当溶解氧低于3～4mg/L时，鱼类就可能窒息而死亡。测定溶解氧要专门取样，通常采用碘量法和离子选择电极法（专用测氧仪）。

六、思考题

①测定水中溶解氧的基本原理是什么？与BOD5的测定有何相同之处。

②测定溶解氧有何意义？

③三价铁离子对测定有何干扰？如何消除？