第三节　心血管疾病中医证候的分子生物学基础研究

辨证论治是中医诊断的精髓，证候研究是中医现代化的必经之路，随着人类对世界的探索不断由宏观转为微观，使证候研究的引向深入成为可能。通过借助转录组学、表观遗传学、蛋白组学等分子生物学技术寻找与中医证候相关的基因、蛋白，体现证候的变化，可以揭示中医证候的科学内涵，使疾病辨证分型和用药具有客观性、准确性及重复性。

一、心血管疾病血瘀证与血管凝血功能的分子机制研究

研究证明，血瘀证患者血小板聚集性亢进，血小板活化因子释放增加，有血栓形成倾向。目前研究证实血瘀证与血小板功能相关，特别是与血小板前列腺素代谢亢进有关。

TXA₂是目前已知最强的缩血管物质和血小板聚集剂之一，具有促血栓形成的作用。PGI₂是血小板功能抑制物，对血小板聚集引起的血管痉挛有保护作用；生理状态下，两者活性保持相对平衡。在血瘀证状态，TXA₂-PGI₂平衡失调，表现为TXA₂升高明显，而PGI₂变化不大或减少。研究发现，脑血管疾病血瘀证、脾虚血瘀证、衰老血瘀证发病机制中的一个重要环节就是TXA₂-PGI₂失衡。

GMP-140是存在于血小板内α颗粒膜上，当血小板活化时，在血小板膜表面表达的一种糖蛋白，其特异性与敏感性较其他表面标志蛋白为佳，血浆GMP-140含量的改变在一定程度上反映了体内血小板活化、释放及破坏程度。对72例老年气虚血瘀型Ⅱ期高血压患者的血浆GMP-140水平进行检测，并与30例老年健康人进行比较，发现患者血浆GMP-140水平较健康人显著升高，72例中42例用补气活血通络的益脉降压流浸膏治疗，30例用卡托普利对照，观察到益脉降压流浸膏治疗组GMP-140水平与对照组相比有明显改善，从而反证了血瘀证与GMP-140的相关性。

目前认为，GP Ⅱb Ⅲα是血小板聚集过程的终末通路，血小板被激活后，各自通过表面的GP Ⅱb Ⅲα受体与配体结合而相互作用，形成血小板聚集体。将不同浓度的血府逐瘀液与血小板和体外培养人脐带内皮细胞共同作用，用放射免疫方法测定血小板膜GP Ⅱb Ⅲα复合物，结果发现血府逐瘀液能明显抑制二磷酸腺苷诱导的GP Ⅱb Ⅲα复合物分子表达。

纤溶系统（fibrinolytic system）活性主要由循环血中t-PA和PAI水平反映，两者活性的变化能直接影响血浆促凝和抗凝功能状态，因而与血瘀证密切相关。对56例血瘀证患者进行了血浆t-PA及PAI和11项血细胞参数的检测和分析，发现血瘀证患者t-PA活性显著低于健康人组，而PAI活性显著高于健康人组，加上11项血细胞参数只有t-PA、MCV对血瘀证具有一定的敏感性诊断价值，因而认识到血细胞参数和纤溶指标的联合检测的方式，对血瘀证的诊断和筛选意义更大。血瘀证的发生是多因素作用的结果，其中纤溶系统起主导作用，为血瘀证的防治提供了依据。

对66例急性脑梗死（ACI）急性血瘀期风痰瘀阻、气虚血瘀、痰热腑实证三组患者进行血管内皮细胞活性因子检测，发现t-PA活性各证型比较差异有显著性，其他指标组间比较未见统计学差异；与健康人组比较，三型的t-PA活性均显著下降，其中气虚血瘀型的活性下降更显著。此外，PAI活性、TXB2及FN含量也存在不同程度的变化，但差异无显著性，说明上述三种证型的病变基础为纤溶系统活性下降。逐步回归分析（logistic）表明，影响血瘀程度的最主要因素是纤溶系统缺损严重程度、t-PA活性和年龄；而且血瘀证积分值与单项指标间并无正负相关性，说明单指标无助于区别ACI急性血瘀期型别，应进行多指标综合分析。

血管内皮细胞可分泌多种生物活性物质，如TPA、PAI、PGI₂、ET、EDRF、NO等各类因子，这些因子水平可以反映血管内皮细胞的内分泌功能。其中内皮素（ET）是目前所知的最强的血管收缩剂，又是血管内皮损伤性疾病共同的重要致病因子。内皮依赖性舒张因子EDRF通过NO起作用，NO有极强的舒张血管作用，对血小板聚集和血栓形成有强烈的抑制作用，并保护血管内皮。若血管内皮细胞分泌功能异常，NO与ET失衡，必然导致血管舒缩功能紊乱，血管内皮受损及通透性改变，同时引发血液成分、血流变特性的改变，表现出血瘀证的特征。

对20例血瘀证患者体内NO及ET水平进行检测，发现患者NO及NO/ET比值均明显低于对照组。对38例冠心病心肌缺血患者进行检测，发现患者的ET水平明显高于健康人，用益气活血祛瘀的心脉通胶囊治疗后，治疗组ET、症状计分降低及ST段上升明显大于对照组。对98例动脉硬化闭塞症（ASO）血瘀证患者血浆内皮素（ET）、一氧化氮（NO）、细胞黏附内皮细胞活性因子及其变化规律测定，发现患者均存在高ET和低NO血症，提示血管内细胞分泌功能异常及由此引起的血液流变学变化可能是血瘀证发生的病理基础之一。

研究发现，在冠心病、高血压等心血管疾病以及糖尿病、肾脏疾病、银屑病等病的血瘀证型，血浆ET增高，推断ET有望成为血瘀辨证新的客观指标。中医药治疗冠心病及由此引起的血液流变学变化如高血压、肺心病、脑梗死、糖尿病肾病等过程中，在取得临床疗效的同时，ET水平相应下降，表明在许多相关疾病的临床研究中，ET有望成为有用的中医药疗效观察和预后判断参考指标。

通过130例急性心肌梗死（AMI）、脑血栓形成患者及90例心绞痛、短暂性脑缺血发作患者进行血液检测，与健康人相应检测值进行比较，判断各指标在心脑血管血栓性疾病及血栓前状态诊断中的意义。结果发现，心脑血管血栓形成的敏感指标有异，P-选择素、t-PA含量是心血管疾病血栓形成的敏感指标；NO是脑血管疾病血栓形成的敏感指标；PAI-1、t-PA：A、D-二聚体三项指标在心脑血管疾病血栓形成中均敏感。P-选择素在血栓前状态形成中所起的作用最强，并在血栓时呈现高水平；t-PA：A减低和PAI-1：A升高在血栓形成中起着持续作用，提示血瘀证的研究应注意不同疾病指标的特异性与不同阶段指标的变化性。

血瘀证的细胞和分子水平研究，目前涉及血小板相关因子、纤溶系统相关因子、血管内皮细胞分泌功能、基因表达等方面。总结上述内容可以看出，同是血瘀证，不同的疾病，可以有相同指标的显著升高；不同疾病血瘀证也可能有各自特异指标的升高，但并不显著。目前所认为的血瘀证与非血瘀证之间有相同的指标升高，但并不显著。前两点对辨病辨证、不同疾病的辨证分型有意义，后者还需进一步研究。在以后的研究中，尚需做更多的、更严格的临床科研设计，以寻找血瘀证区别于其他证型的客观指标，这是血瘀证诊断客观化、标准规范化的需要。随着现代科学技术的发展及细胞分子水平的研究进展，血瘀证将得到进一步的阐释，对血瘀证的预防、诊断和治疗将有更大的指导意义。

二、心血管疾病证候的组学机制研究

组学包括DNA、mRNA、蛋白三个方面。而DNA甲基化和组蛋白修饰在DNA修饰层面影响mRNA的转录，miRNA与lncRNA一同影响mRNA的表达（图2-1）。

图2-1　组学内容

1939年，C.H.Waddington首先引入了表观遗传学（epigenetics）这个术语，指的是“基因和它们的产物之间的因果关系，使表型得以存在”。而今，表观遗传学被重新定义为有丝分裂和减数分裂中遗传基因表达发生变化却没有任何突变的DNA序列。表观遗传修饰主要涉及DNA甲基化，组蛋白修饰，microRNA（miRNA）和长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。RNA是核酸。miRNA和lncRNA是有争议的表观遗传因子，因为表观遗传通常指的是对基因表达的非遗传性影响。然而miRNA和lncRNA影响转录和转录后沉默的过程。因此，广义上来说，其也是表观遗传学的一部分。

DNA甲基化是指通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用，在5’-CpG-3’的第5个碳原子上合成甲基（图2-2）。DNA甲基化涉及各种细胞的生理和病理活动，如时间和空间特异性基因表达，X染色体不激活，衰老，癌症和心血管疾病。家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia，FH）和冠心病患者的DNA甲基化水平较低。DNA甲基化与性别/种族/民族以及冠心病危险因素（非冠心病发病率）显著相关。在冠心病患者中，易发生动脉粥样硬化的动脉和不易发生动脉粥样硬化的动脉，DNA甲基化水平是不同的。在来源于包含晚期动脉粥样硬化斑块的右冠状动脉中，位于miRNA-10b的四个CpG位点被确认为低甲基化。

血瘀证是冠心病的主要证型，几乎贯穿于冠心病发展的始末。对于冠心病血瘀证这一冠心病中最重要的证型，已有一些试验对此展开了DNA甲基化的研究（表2-3）。在收集14例家系冠心病血瘀证患者和7例家系健康人的研究中，学者采用表达谱芯片检测冠心病血瘀证的差异表达基因。再收集16例冠心病血瘀证患者和7例健康人，通过启动子区甲基化特异性PCR（methylation specific PCR，MS-PCR）研究，初步分析冠心病血瘀证差异表达基因及其启动子区甲基化状态芯片表达谱，共获取差异表达基因26个，其中选择KLF5和LRP12基因进行MS-PCR，但是发现冠心病血瘀证的这两个基因启动子区甲基化状态和健康人比较无明显区别。而为了研究雌激素受体β基因在动脉粥样硬化及冠心病发展中的影响，有研究者开始探究其启动子区CpG岛甲基化状况在早发性冠心病血瘀证发生发展中的变化，其收集了早发冠心病血瘀证标本16例，冠心病非血瘀证8例，健康人8例，采用MSPCR技术对上述基因CpG岛甲基化状态进行检测。结果发现ER-β基因甲基化可能与早发冠心病血瘀证的发生发展具有一定相关性。另外也有研究，收集非血缘性（气滞、痰浊、气虚）冠心病血瘀证组3例，冠心病非血瘀证组3例与健康对照组3例检测，先采用芯片检测基因DNA甲基化的方法筛选出DNA甲基化变化的位点，检测冠心病血瘀证DNA甲基化差异基因，从中选出非血缘性冠心病血瘀证两个甲基化改变的易感基因CTNNB1、DES；采用RT-PCR技术对非血缘性冠心病血瘀证亚型进行加减养心通脉方干预，检测干预前后这两个基因表达变化。研究发现DES和CTNNB1基因的DNA甲基化修饰可能是冠心病血瘀证的易感危险因素，加减养心通脉方对冠心病（气滞、痰浊、气虚）血瘀证三个亚型DES基因表达有明显的调控作用，但对CTNNB1基因表达无明显的调控作用。多个研究发现，在冠心病血瘀证中，特定位点确实会出现DNA甲基化程度的差异，包括ER-β的启动子区域、DES和CTNNB1基因等。

图2-2　DNA甲基化示意图

通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用，在5′-CpG-3′的第5个碳原子上合成甲基（绿色小球），DNA甲基化作用会抑制基因的转录

在最新的研究中，有学者选择冠心病不稳定型心绞痛血瘀证组、冠心病不稳定型心绞痛非血瘀证组、非冠心病血瘀证组、正常对照组各10例。使用高通量测序技术、生物信息学方法筛选出冠心病血瘀证的差异基因。对获得的差异基因进行聚类分析、主成分分析、GO功能富集和KEGG信号通路分析且进行qPCR验证。结果发现，冠心病血瘀证相关差异表达基因主要与免疫和炎症相关，确定miR194 promoter-miR194-MAPK信号通路的关键节点。随后，研究者收集84例冠心病血瘀证患者，随机分为两组（试验组和对照组），发现冠心病血瘀证发生变化时，miR194 promoter-miR194-MAPK信号通路中的关键节点均出现改变。

表2-3　心血管疾病血瘀证的组学研究

续表

miRNA处于动态变化水平，相比于DNA甲基化改变，反应更为敏捷。有关于此的研究在近几年迅速发展。ENCODE项目表明，虽然有大约90%的人类基因被转录，然而只有1%～2%的DNA可以编码蛋白质，许多基因受非编码RNA调控。miRNA在非编码RNA（19～23个核苷酸）中起重要作用。1993年，首次发现lin-4 miRNA；然而，直到2000年，Pasquinelli在Science杂志的一篇文章中指出21个核苷酸的let-7 microRNA具有高度保守性，它才引起人们的重视，同时也标志着现代microRNA生物学的诞生。在接下来的10年中，大量的研究表明miRNA参与大多数生物过程，在多细胞生物体中发挥重要作用，用于生物生长分化，细胞增殖和凋亡。miRNA调控具有不完善的组合和微调的特点。miRNA通过与数百个目标mRNA密切或不紧密结合，从而破坏mRNA的稳定性并抑制mRNA的转录。

miRNAs的合成，是从RNA聚合酶Ⅱ转录生成原始miRNAs（pri-miRNAs），Pri-miRNAs由核内的RNA内切酶Ⅱ（RNAse-Ⅱ）Drosha修饰形成miRNAs前体（pre-miRNAs），从细胞核转运到细胞质。在细胞质中，形成成熟的miRNA单链，并结合到RNA介导的沉默子复合体中，从而发挥作用（图2-3）。

一些心脏特异性miRNA已经显示出一些关键的诊断价值，包括miR-1，miR-133和miR-208。2008年，在血液，血小板和红细胞中发现了miRNA。在低pH或高pH，多次冻融循环和室温下长期储存的条件下，血浆miRNA总能保持稳定。miR-208是一种独特的miRNA，仅在心脏中表达。它不会被非心脏疾病干扰。miR-208a可通过负调节类神经激酶（neurokinase-like kinase，NLK）的表达来促进Ang Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡。在体外，miR-208a的过度表达通过下调NLK和抗凋亡蛋白Bcl-2，大大增强了Ang Ⅱ诱导的H9C2细胞凋亡，而当miR-208a被下调时，这些作用能被逆转。

2013年研究者首次构建冠心病血瘀证大鼠模型，通过基因芯片技术筛选出差异表达的miRNA，发现miR-384在冠心病血瘀证中有差异化表达，而进一步的过表达与抑制的细胞实验进一步说明了冠心病中miR-384起到了保护作用。同年，有团队首次筛选出冠心病血瘀证患者差异表达的microRNA。对冠心病血瘀证患者、冠心病非血瘀证患者、非冠心病血瘀证患者和健康对照者的microRNA表达谱和基因表达谱进行检测和分析。结果发现，各组microRNA表达谱皆存在差异。在不稳定型心绞痛血瘀证中，上调的miR-146b-5p和miR-199a-5p可能通过下调CALR和TP53以减轻炎症和凋亡。qRT-PCR验证证实了各种证候中具有关键调控作用的microRNA和靶基因的表达模式，其结果提示：miR-146b-5p、miR-199a-5p、CALR和TP53可以作为不稳定型心绞痛血瘀证患者的生物标志物。接着，团队观察了血塞通干预冠心病血瘀证患者外周血hsa-miR-199a-5p，hsa-miR-146b-5p，KIR3DS1，HLA-DPB1，TP53SESN2，NCR1，PRF1表达的影响。结果发现，血塞通可有效改善冠心病不稳定型心绞痛血瘀证患者症状，其机制可能与调控hsa-miR-199a-5p，hsa-miR-146b-5p相关。也有研究同时筛选了冠心病血瘀证相关差异表达的lncRNA-miRNA-mRNA，构建基因间调控网络。使用高通量测序技术，分别检测冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证和正常组中lncRNA，miRNA和mRNA的表达情况。最新的研究已经发展到以miRNA确定血瘀证轻重的水平。有研究将60例ACS患者按血瘀证计分标准分为ACS血瘀轻证组和血瘀重证组，另选30例健康志愿者做对比。采用qPCR比较各组4种循环microRNA（miR-208a-3p、miR-222-3p、miR-16、miR-198）表达水平。最终发现miR-208a-3p可作为ACS血瘀证与健康志愿者的判别，但不能用于判别血瘀轻重。miR-222-3p、miR-198可能在协助判别血瘀轻重方面具有一定意义。血瘀证计分越高，则GRACE预测积分越高，预后越差。在最新的研究中，本团队采用随机双盲对照试验方法，观察丹参多酚酸盐干预冠心病非ST段抬高型心肌梗死血瘀证患者的临床疗效，qPCR法检测患者治疗前后相关miRNA及靶基因调控网络的变化。

图2-3　microRNA生成示意图

lncRNA是一种新型的非蛋白编码转录物，已经引起了研究者的极大兴趣。lncRNAs是一类长度大于200nt的非编码RNA分子，具有广泛的基因调控功能。lncRNA在生物学过程中起重要作用，包括染色体重组，细胞分化和免疫应答。一些新的lncRNAs在心脏功能中起着重要的作用。用健康受试者和患有CAD和高胆固醇血症的患者的HDL处理HUVEC24小时。不同的管理策略导致了lncRNAs，基因和mRNA的不同表达水平，差异表达的lncRNAs影响了血管内皮的调节功能。lncRNA，坏死相关因子通过靶向miR-873参与了心肌细胞凋亡的调控和再灌注过程中心肌缺血的减少。lncRNA UCA1通过抑制p27的表达参与心肌I/R期间心肌损伤的发生。在另一匹配队列中（每组各15例），使用高通量测序技术及生物信息学分析方法，对冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证和正常对照进行两两比较交联，发现39个lncRNA在冠心病血瘀证中差异表达。根据调控关系集构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，经过网络拓扑分析和韦恩，3个lncRNA（CTA-384D8.35、CTB-114C7.4和RP11-567M16.6）和1个miRNA（hsa-miR-3158-3p）被认为是网络中的关键节点。挑选基因调控网络中关键节点（CTA-384D8.35和CTB-114C7.4）和miRNA（miR-3196和miR-3656）进行基因干扰。结果显示该网络中lncRNA、miRNA、mRNA存在多种调控模式。而在活血化瘀组分配伍药物的干预后，对治疗前后的样本进行比较，发现患者症状有所改善，而相应的lncRNA及mRNA的表达谱也会发生变化，基因功能主要集中在氧气运输以及维持氧稳态、细胞膜运输与成肌分化、丝状伪足形成以及免疫过程方面。

circRNA作为非编码RNA之一，具有高稳定性、物种间的高保守性以及组织特异性等特点，已被研究者视为有望成为临床诊断、治疗及预后等新的分子生物标志物及靶向治疗靶点的潜能。近年来，研究也发现circRNA可通过“海绵”作用与疾病相关联的miRNA相互作用或通过与蛋白质相结合参与基因表达调控并影响蛋白质功能等作用，参与诸如肿瘤、神经系统紊乱、心血管疾病、糖尿病等疾病的发生、发展过程，并发挥着重要的调控作用。

有研究采集实验标本25例，分为冠心病气滞血瘀证组、冠心病非气滞血瘀证组、慢性胃炎气滞血瘀证组、类风湿关节炎气滞血瘀证组及健康对照组各5例，采集外周血，提取总RNA，进行高通量测序。找到气滞血瘀证circRNA差异表达的有4个，分别是circRNA-09849、circRNA-11523、circRNA-18046、circRNA-24450，其中circRNA-11523可与已知的circBase中has-circ-0005860相关，其余三个为新发现的circRNA。

在mRNA层面，有研究者应用寡核苷酸基因芯片技术，研究血瘀证患者差异基因表达谱。将16例血瘀证患者经冠状动脉造影诊断后，分为冠心病血瘀证组和非冠心病血瘀证组，每组8例；并选年龄和性别相匹配的8名健康人为健康对照组。抽取静脉血，分离白细胞，抽提RNA，质控芯片（Test3芯片）对样本质量进行检测，然后与Affymetrix U133 Plus 2.0芯片进行杂交，通过扫描和软件分析，比较冠心病血瘀证组、非冠心病血瘀证组与健康对照组的基因表达谱，筛选血瘀证相关差异基因，并进一步进行基因本体（gene ontology，GO）和通路分析，使用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法对目标基因进行验证。研究发现，通过差异基因筛选，与血瘀证相关的差异基因共有48个，其中上调基因26个，下调基因22个；通过GO分析，其中与炎症免疫相关的基因有5个，占10.4%；通路分析结果显示，有意义的10条通路中有5个涉及炎症和免疫反应。经实时荧光定量逆转录聚合酶链反应验证了基因芯片准确可靠。研究认为，血瘀证基因表达谱研究显示了炎症和免疫相关基因的比例和显著性优势，说明炎症和免疫反应在一定程度上介导了血瘀证的发生发展。

本团队为筛查冠心病血瘀证病证结合证候相关基因，采用临床符合诊断标准的冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证患者和正常健康者共40人，运用外周血mRNA差异显示获得差异条带、反向Northern法阳性验证、克隆测序，并进行生物信息学分析和临床验证。结果发现，28条真实差异基因片段序列，与人类基因数据库中比对分析，获得的b13与人类基因淋巴细胞活化因子1有100%的同源性，在冠心病血瘀证组显著表达。研究发现，差异基因b13通过T淋巴细胞的活化，引起免疫反应，导致进一步内皮损伤，刺激内皮细胞表达细胞因子、趋化因子及细胞黏附分子，促进炎性细胞黏附及脂质沉积，参与了内皮损伤和动脉硬化的形成，与冠心病血瘀证的病理改变密切相关。

随着人类对世界的探索不断由宏观转为微观，使证候的研究引向深入成为可能，以往对于血瘀证本质的研究慢慢从血液流变学、血液黏度、血小板聚集性及血脂代谢方面入手。中医理论中，气为血之帅，血为气之母；气行则血行，气滞则血瘀。心脑血管疾病的发生发展过程中均可见到血瘀证。

蛋白组学的方法可对心血管疾病血瘀证对诊断和积极治疗提供有力的依据。通过对比冠心病血瘀证病人与正常人的血浆，发现有3个蛋白质下调和6个蛋白质上调，升高的蛋白质有免疫球蛋白纤维蛋白原、粒酶等，降低的蛋白质有CD44SP等。为寻找冠心病血瘀证患者冠脉事件的关键血小板功能蛋白，用二维凝胶电泳技术筛选出了13个差异蛋白点，质谱成功鉴定7个，这些血小板功能蛋白的异常表达可能在冠心病血瘀证事件发生发展中起关键作用。更有研究通过比对高脂血症及动脉粥样硬化不同证候（痰证、血瘀证、痰瘀互阻证）血浆差异蛋白质的表达谱发现，能区分痰证与瘀证可能的标志蛋白群是结合珠蛋白前体、肾上腺髓质素结合蛋白前体、补体C4和白蛋白。

运用蛋白组学技术，建立血瘀证的识别模式，也有利于提高脑血管疾病血瘀证患者的辨证准确性，为辨证施治提供依据。通过比对急性期缺血性中风血瘀证患者和非血瘀证患者的血浆，共发现了6个差异表达蛋白质，其中结合珠蛋白、SP40/40、纤维蛋白原γ链等5个蛋白质表达上调，主要与细胞的能量代谢、蛋白质磷酸化和细胞骨架等有关系，具有标志性意义。更有研究表明，在急性缺血性脑卒中患者中，血瘀证与C反应蛋白有正相关性（相关系数3.020，P=0.038，OR=20.499），而与甘油三酯、血清总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白值无明显相关性。

在过去的三十余年里，对于心血管健康和疾病方面组学的理解得到了迅速的发展。这些组学研究提供了冠心病的作用机制、诊断标志和治疗目标的新视角。同时，表观遗传修饰的可变性和普遍性对其在冠心病中的作用提出了挑战。