第七节 创伤感染常见厌氧菌
厌氧菌是一大群在有氧条件下不能生长，仅在无氧条件下利用发酵而获取能量的细菌。它们分布广泛，土壤、沼泽、湖泊、海洋、河流的沉渣、污水、食品以及人和动物体都有它们的存在。正常人的腔道包括肠道，口腔，阴道等处均有大量的厌氧菌寄居，它们与需氧菌一起共同组成人体的正常菌群。此外，人体皮肤、呼吸道、泌尿道也有厌氧菌分布。在正常情况下，寄居于人体的正常菌群对人无损害，与人体保持平衡状态，而且正常菌群之间也相互制约，维持相对的平衡。但当机体的防御功能减弱时，如皮肤黏膜受伤（如创伤、吸血昆虫或动物的叮咬、某些外科手术）改变了宿主和正常菌群之间的平衡状态，寄居的正常菌群也可引起疾病。由于寄居部位的改变，厌氧菌从正常寄居部位转移至组织或体腔，从而可导致内源性感染，是微生物与宿主相互作用结果。此外，还由于某种原因破坏了正常菌群内各种微生物种之间的相互制约的关系，即所谓菌群失调，也可引起内源性感染。例如，长期使用广谱抗生素，使敏感的菌株被抑制，不敏感的细菌包括厌氧菌则大量繁殖，由此引起病变。在正常情况下，人体组织的氧化还原电势（Eh）可阻碍厌氧菌的繁殖。组织缺氧或Eh降低都可造成厌氧菌生长繁殖的适宜环境。创伤的性质，多见于大面积外伤、弹伤和刺伤等，都可使组织氧张力或Eh降低，从而为厌氧菌繁殖提供良好条件。
本节主要介绍创伤感染中常见的厌氧性细菌芽孢破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和无芽孢厌氧菌。
一、芽孢破伤风梭菌
破伤风梭菌（Clostridium tetani）是破伤风的病原体，是特殊的创伤感染菌。广泛存在土壤、健康动物和人的肠道中。当该菌通过创伤的皮肤或黏膜进入机体时，或分娩时使用不洁器械剪脐带等，此菌即可侵入伤口生长繁殖，释放外毒素，导致破伤风。本病以骨骼肌发生强直性痉挛为特征，可因窒息或呼吸衰竭而死亡。如不及时预防，一旦发病死亡率很高。据估计世界每年有100万病例发生，死亡率在30%～50%之间，其中一半的死亡病例是新生儿。目前，主要是成人的工伤、创伤的感染。
（一）生物学性状
破伤风梭菌是革兰阳性细长的杆菌，0.5～1.7μm X 2.1～18.1μm，在体内外都形成芽孢，芽孢在菌体顶端，呈正圆形、形成鼓槌状特殊形态，有鞭毛，无荚膜。
破伤风梭菌为专性厌氧菌，普通培养基即可生长，羽毛状菌落及薄膜状爬行生长物。血平板上有轻度溶血环，庖肉培养基中轻度混浊，肉渣微变黑，产生咸臭气体。大多生化反应阴性，不发酵糖类，不分解蛋白质。破伤风梭菌的芽孢抵抗力强，在干燥的土壤和尘埃中能存活数年。芽孢通常100℃一小时可被完全破坏，其繁殖体对青霉素敏感。
（二）致病性与免疫性
1. 致病条件
伤口深而狭窄（如刺伤），创口闭合造成局部乏氧；大面积创伤、烧伤，坏死组织多，吸收游离氧；局部组织缺血缺氧；伤口进入泥土或异物，带入破伤风梭菌或其芽孢，同时伴有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染，需氧菌或兼性厌氧菌生长消耗氧气而造成厌氧环境。以上原因均可造成有利于破伤风梭菌生长繁殖的厌氧微环境。
2. 致病物质
破伤风梭菌侵袭力弱，仅在局部繁殖，其致病作用完全有赖于病菌所产生的毒素。破伤风梭菌能产生两种毒素，一种是对氧敏感的破伤风溶血毒素（tetanolysin），其在功能上和抗原性与链球菌溶血素O相似，但在致破伤风中的作用尚不清楚。另一种为质粒编码表达的破伤风痉挛毒素（tetanospasmin），是引起破伤风的主要致病物质。破伤风痉挛毒素属神经毒（neurotoxin），毒性作用极强，对人的致死量小于1g，腹腔注入小鼠的半数致死量（LD50）为0.015ng。该毒素在细菌溶解时释放，其化学性质为蛋白质，不耐热，可被肠道蛋白酶破坏，故口服毒素不起作用。细菌最初合成的痉挛毒素为一条分子量约150kDa的多肽，释出菌体时，即被细菌蛋白酶裂解为一条分子量约50kDa的轻链（A链）和一条100kDa的重链（B链），轻链和重链间由二硫键联接在一起。其中轻链具有毒性作用，重链能结合神经细胞和转运毒素分子。
3. 致病机制
毒素对脑干神经细胞和脊髓前角细胞有高度亲和力。毒素可由末梢神经沿轴索从神经纤维间隙，到达脊髓前角，直至脑干。也可通过淋巴、血液到达中枢神经系统，而致病。重链通过其羧基端识别神经肌肉结点处运动神经元外胞浆膜上的受体并与之结合，促使毒素进入细胞内由细胞膜形成的小泡中。小泡从外周神经末梢沿神经轴突逆行向上，到达运动神经元细胞体，通过跨突触运动（trans-synaptic movement），小泡从运动神经元进入传入神经末梢，从而进入中枢神经系统。然后通过重链氨基端的介导产生膜的转位使轻链进入胞质溶胶。轻链为一种锌内肽酶（zinc endopeptidase），可裂解储存有抑制性神经介质（甘氨酸和γ氨基丁酸）小泡上膜蛋白特异性肽键，使小泡膜蛋白发生改变，从而阻止抑制性神经介质的释放。机体在正常生理情况下，当机体屈肌的运动神经元受到刺激而兴奋时，同时还有冲动传递给抑制性神经元，使其释放出甘氨酸和γ氨基丁酸抑制性介质，以抑制同侧伸肌的运动神经元，因此，当屈肌收缩时伸肌自然松弛，肢体屈伸动作十分协调。此外，屈肌运动神经元还受到抑制性神经元的反馈调节，使屈肌运动神经元的兴奋性强弱受到控制，不致过高。当破伤风痉挛毒素阻止抑制性神经介质的释放，破坏正常的抑制性调节功能，干扰了抑制性神经元的协调作用。使肌肉活动的兴奋与抑制失调，导致伸肌和屈肌同时强烈收缩，肌肉出现强烈痉挛。
4. 所致疾病
破伤风，横纹肌痉挛。破伤风的潜伏期从几天到几周不等，平均7～14天，与原发感染部位距离中枢神经系统的长短有关。感染越接近头部潜伏期就越短，病死率越高。临床表现的前驱症状为感染处肌肉痉挛，咀嚼困难、激动、多汗。继而全身肌肉痉挛，形成苦笑面容，角弓反张，轻者呼吸困难，重者窒息死亡。因自主神经系统功能紊乱，还可产生心律不齐、血压波动和因大量出汗造成的脱水。
破伤风免疫是典型的外毒素免疫，主要由抗毒素发挥中和毒素毒性的作用。破伤风痉挛毒素毒性很强，极少量毒素即可致病，而如此少量的毒素尚不足以引起免疫，且毒素与组织结合后，也不能有效刺激免疫系统产生抗毒素，故病后不会获得牢固免疫力。获得有效抗毒素的途径是进行人工免疫。
（三）微生物学检查
根据典型症状和病史（创伤史）即可诊断。伤口直接涂片镜检和病菌分离培养阳性率低，对早期诊断无意义，故一般不进行。动物实验可以确定有无毒素。
（四）防治原则
1. 非特异性防治措施
正确处理创口，及时清创扩创，防止厌氧微环境的形成；应用甲硝唑等药物，抑制破伤风芽孢梭菌在局部病灶繁殖等。
2. 特异性防治措施
目前我国采用含有百日咳疫苗、白喉类毒素和破伤风类毒素的百白破三联制剂，对3～6个月的儿童进行免疫，刺激机体产生相应抗毒素，可同时获得对这三种常见病的免疫力。免疫程序为婴儿出生后第3、4、5个月连续免疫3次，2岁、7岁时各加强一次，以建立基础免疫。今后如发生可能引起破伤风的外伤，立即再接种一次类毒素，血清中抗毒素滴度在几天内即可迅速升高。妊娠妇女接种破伤风类毒素可预防新生儿破伤风。战士、建筑工人和易受外伤的人群，第一年注射2次作基础免疫。第二年加强免疫1次。每隔5～10年注射1次。受外伤时再注射1次。对伤口污染严重而又未经过基础免疫者，可立即注射破伤风抗病毒素（tetanus antitoxin，TAT）以获得被动免疫作紧急预防。剂量为1500～3000单位。注射TAT被动预防的同时，可给予类毒素同时作主动免疫。
3. 特异性治疗
对已发病者应早期、足量用TAT治疗，一旦毒素与细胞受体结合，抗毒素就不能中和其毒性作用。剂量为10万～20万单位，包括静脉滴注、肌内注射和伤口局部注射。由于目前应用的TAT是用破伤风类毒素免疫马所获得的马血清纯化制剂，因此注射前，无论用于紧急预防还是治疗，都必须先作皮肤试验，测试有无超敏反应。必要时可采用脱敏注射法或用人抗破伤风免疫球蛋白。抗菌治疗可采用四环素，红霉素。
二、产气荚膜梭菌
产气荚膜梭菌（C.perfringerus）广泛分布于自然界及人与动物消化道，能引起人和动物多种疾病。根据其主要毒素的抗原性不同，菌株分为A、B、C、D、E5种类型（毒素型），其中A型产气荚膜梭菌是引起人类气性坏疽和食物中毒的主要病原菌。C型是坏死性肠炎的病原菌。
（一）生物学性状
产气荚膜梭菌是革兰阳性粗大杆菌，0.6～2.4μm X 1.3～19.0μm，椭圆形芽孢位于中央或近极端，不大于菌体，但在组织中和普通培养基上很少形成。无鞭毛。在被感染的人或动物体内有明显的荚膜。专性厌氧。20～50℃均能旺盛生长，在其最适生长温度42℃时，繁殖周期仅为8分钟，易于分离培养。血平板上有双层溶血环，内环θ毒素引起完全溶血，外环α毒素引起不完全溶血。在蛋黄琼脂平板上，菌落周围出现乳白色混浊圈，是由细菌产生的卵磷脂酶（α毒素）分解蛋黄中卵磷脂所致。若在培养基中加入α毒素的抗血清，则不出现混浊，此现象称Nagler反应，为本菌的特点。本菌代谢十分活跃，可分解多种常见的糖类，产酸产气。在庖肉培养基中可分解肉渣中糖类而产生大量气体。在牛乳培养基上生长，分解乳糖产酸，可凝固酪蛋白，同时产生大量气体（H2和CO2），将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，并把培养基表面封固的凡士林向上推开，甚至冲走试管口棉塞，这种现象称为“汹涌发酵”（stormy fermentation），为本菌鉴别的主要特征。
（二）致病性
1. 致病物质
产气荚膜梭菌产生多种侵袭性酶和外毒素。外毒素有10余种，重要的有：①α毒素为卵磷脂酶，为最重要的毒性物质，5种毒素型均能产生，以A型产生量最大。能分解人和动物细胞膜上的磷脂和蛋白形成的复合物，使多种细胞（红细胞、白细胞、血小板和内皮细胞）的细胞膜受损，引起溶血、组织坏死、血管内皮损伤、肝脏和心功能受损、血管通透性增高等病变，在气性坏疽的形成中起重要作用；②θ毒素具有溶血和破坏白细胞的作用；K毒素即胶原酶，可分解肌肉和皮下的胶原组织，使组织崩解；③μ毒素是透明质酸酶，有利于细菌及毒素的扩散；④很多A型菌株和少数C、D型菌株还能产生肠毒素，为不耐热的蛋白质，100℃瞬间被破坏。其作用机制是整段肠毒素肽链嵌入细胞膜，破坏膜离子运输功能，改变膜的通透性，而引起腹泻。肠毒素主要作用于回肠，其次为空肠，对十二指肠基本无作用。肠毒素还可作为超抗原，能大量激活外周T淋巴细胞并释放各种淋巴因子，参与致病作用。
2. 所致疾病
主要引起以下疾病：①气性坏疽（gas gangrene）：多见于战伤、大面积创伤的工伤、车祸。是严重的创伤感染性疾病，以局部组织坏死、气肿、水肿、恶臭及全身中毒为特征。气性坏疽潜伏期短，一般为8～48小时，病菌通过产生多种毒素和侵袭性酶，破坏组织细胞，发酵肌肉和组织中的糖类，产生大量气体，造成气肿；同时血管通透性增加，水分渗出，局部水肿，进而挤压软组织和血管，影响血液供应，造成组织坏死。严重病例表现为组织胀痛剧烈，水气夹杂，触摸有捻发感，最后产生大块组织坏死，并有恶臭。病菌产生的毒素和组织坏死的毒性产物被吸收入血，引起毒血症、休克，死亡率高达40%～100%。②食物中毒：多见于因食入被A型产气荚膜梭菌污染的食物（主要为肉类食品）而引起。这些菌通过胃进入小肠，在肠道内形成芽孢同时产生肠毒素，聚集于芽孢囊内，当菌体细胞自溶或芽孢游离时肠毒素被释放出来，和小肠上皮细胞结合，增强肠壁细胞的腺苷酸环化酶活性，导致细胞分泌功能亢进，致使水分流出，钠离子、氯离子及葡萄糖吸收障碍，使患者发生腹泻。此时，患者粪便中排出耐热性芽孢。潜伏期约10小时，临床表现为腹痛、腹胀、水样腹泻；无发热、无恶心呕吐。1～2天后自愈。如不进行细菌学检查常难确诊。③坏死性肠炎：是由C型产气荚膜梭菌产生的β毒素引起，引起腹痛、腹泻，并伴有血便，病死率较高。
（三）微生物学检查
1. 直接涂片检查
这是极有价值的快速诊断法，具有重要的临床意义。从感染伤口深部取材，染色镜检，发现革兰阳性大杆菌，少量不规则白细胞和伴有其他杂菌这三大特点即可作初步报告。
2. 分离培养
取坏死组织制成悬液，接种于血平板或庖肉培养基作厌氧培养，观察生长情况，取培养物涂片镜检，并用生化反应鉴定。
3. 动物实验
将标本厌氧培养，取细菌培养液0.5～1ml静脉注射小鼠，5～10分钟后将动物处死，置37℃温箱孵育6～8小时，见尸体膨胀并有恶臭，解剖见脏器内有大量气泡，以肝脏最为明显，称“泡沫肝”，涂片镜检并分离培养。
4. 细菌培养计数
疑为产气荚膜梭菌引起的食物中毒，在发病后一日内可取剩余食物或粪便作细菌学检查。若检出大于105病菌/克食物或106病菌/克粪便可确立诊断。
5. 食物中毒诊断
也可用ELISA等方法直接检测肠毒素。
（四）防治原则
及时正确处理伤口，消除厌氧微环境。对局部感染应尽早施行扩创手术，切除感染及坏死组织，必要时截肢以防止病变扩散。早期大剂量使用多价抗毒素血清控制病情，同时使用大剂量青霉素等抗生素以杀灭病原菌和其他细菌。外科手术前，使用高压氧舱法，提高血液和组织中的氧含量，抑制细菌生长繁殖，减少毒素产生，控制病情发展，同时给予对症治疗。由于该菌在环境中极易形成芽孢，故需严密隔离患者，并对所用器械及敷料彻底灭菌，避免在医院传播。
三、无芽孢厌氧菌属
无芽孢厌氧菌是一大群厌氧生长，不形成芽孢的细菌。为人体正常菌群，包括革兰阳性和革兰阴性的球菌和杆菌。在人体中存在数量大，主要寄生于人和动物体内，在人体正常菌群中厌氧菌占有绝对优势，是其他非厌氧性细菌（需氧菌和兼性厌氧菌）的10～1000倍。例如在肠道菌群中，厌氧菌占99.9%，大肠埃希菌等只占0.1%。皮肤、口腔、上呼吸道、泌尿生殖道的正常菌群中80%～90%也是厌氧菌。在正常情况下不致病，但在某些特定的条件下，可作为机会致病菌导致内源性感染，严重者甚至危及生命。
（一）生物学性状
1. 革兰阴性厌氧杆菌
是临床感染最常见的菌群，主要菌属有类杆菌属和梭杆菌属。
（1） 类杆菌属：
两端圆而浓染，中间不着色或者色浅，似空泡状，有荚膜。在感染的标本中，细菌呈多形性，有时菌体淡染，一端着色深，似芽孢。在血平板上培养24～48小时，形成圆形微凸的菌落，表面光滑，边缘整齐，一般不溶血。类杆菌属中的脆弱类杆菌（B.fragilis）最重要，为直肠部位的正常菌群。在无芽孢厌氧菌感染中，占临床厌氧菌分离株的25%，类杆菌分离株的50%。本菌在腹部和会阴部感染、败血症等相应标本中常被分离到。产黑色素类杆菌一般为小杆菌，有时呈长杆状，有荚膜和菌毛。因大肠埃希菌产生的维生素可供其生长，故易与大肠埃希菌混合感染。除类杆菌在培养基上生长迅速外，其余均生长缓慢，需3天以上。类杆菌有典型的革兰阴性菌细胞壁，但其脂多糖无内毒素活性，主要是由于其氨基葡萄糖残基上脂肪酸较少和缺乏磷酸基团。
（2） 梭杆菌属：
梭杆菌为革兰阴性细长杆菌，两端尖细呈梭形，无荚膜和鞭毛。多为口腔、直肠黏膜的正常菌群。专性厌氧，血平板上形成灰白色、扁平、半透明菌落。代谢过程中能产生大量丁酸、能将苏氨酸分解为丙酮酸为其生化反应特点。
2. 革兰阴性厌氧球菌
一般不经常引起重要的临床感染。有3个属，其中以韦荣球菌最为重要。直径0.3～0.5μm，成对、成簇或短链状排列，是咽喉部主要厌氧菌，但在临床厌氧菌分离标本中，分离率小于1%，常自软组织脓肿、上呼吸道感染标本及血液中分离出，且为混合感染菌之一。其他革兰阴性球菌极少能分离到。
3. 革兰阳性厌氧杆菌
能引起各种疾病，可以单独或与其他菌混合感染。有7个属，在临床厌氧菌分离株中，占22%，其中短棒菌苗（占57%）、双歧杆菌、真杆菌（23%）较为重要。
（1） 短棒菌苗：
主要存在于皮肤正常菌群中。小杆菌，常呈链状或成簇状排列，呈多形性，无鞭毛，能分解糖类产生大量丙酸和醋酸。能在普通培养基上生长，时间需2～5天。与人类有关的菌种中，痤疮短棒菌苗（P.acnes）最为常见，与皮肤的慢性感染，如痤疮和酒渣鼻等有关，也可因外伤、手术等引起皮肤、软组织感染。
（2） 双歧杆菌属：
呈多形态，有分枝，无荚膜，无鞭毛，严格厌氧，耐酸。分解葡萄糖和乳糖，产生甲酸、醋酸等。双歧杆菌在婴儿、成人肠道菌群中占很高比例，在婴儿尤为突出。该菌在肠道中具有维持肠道微生态平衡，控制pH，拮抗外源性致病菌感染，促进营养物质代谢，增强机体免疫力，以及抗肿瘤、抗衰老等重要作用。只有齿双歧杆菌（B.dentium）与龋齿和牙周炎有关，但其致病作用仍不明确。其他种极少能从临床标本中分离到。
（3） 真杆菌属：
单一形态或多形态，动力不定，严格厌氧，生化反应活泼生长缓慢，常需培养7天。真杆菌是肠道重要的正常菌群。部分菌种与感染有关，但都出现在混合感染中，最常见的为迟钝真杆菌（E.lentum）。
4. 革兰阳性厌氧球菌
有5个属，其中有临床意义的是消化链球菌，以短链或长链状排列，也可成堆排列。消化链球菌主要寄居人体肠道、女性阴道中。在临床厌氧菌分离株中，占20%～35%，为第2位，仅次于脆弱类杆菌。该菌可从阑尾炎、胸膜炎、产后败血症等标本中检出，多与金黄色葡萄球菌等混合感染。厌氧菌菌血症仅1%由革兰阳性球菌引起，主要为本菌属，常因女性生殖道感染而引起。本菌属细菌生长缓慢，培养需5～7天。
（二）致病性
1. 致病条件
无芽孢厌氧菌是寄生于皮肤和黏膜上的正常菌群，当其寄居部位改变，宿主免疫力下降和菌群失调等情况下，伴有局部厌氧微环境的形成，如因血管损伤、肿瘤压迫等组织缺氧或氧化还原电势降低则易引起内源性感染。
2. 细菌毒力
无芽孢厌氧菌在一定条件下大量生长繁殖，毒力主要表现在下列几方面：①通过菌毛、荚膜等表面结构吸附和侵入上皮细胞和各种组织；②产生多种毒素、胞外酶和可溶性代谢物，如脆弱类杆菌某些菌株产生的肠毒素、胶原酶、蛋白酶、纤溶酶、溶血素、DNA酶、透明质酸酶等；③改变其对氧的耐受性，如类杆菌属很多菌种能产生出SOD，以适应新的致病生态环境；④与混合感染的需氧菌或兼性厌氧菌协同作用，表现在氧气的利用，营养的互补和降低对抗菌药物的敏感性等方面。
3. 感染特征
①内源性感染，感染部位可遍及全身，多呈慢性过程；②感染无特定病型，大多为化脓性感染，形成局部脓肿或引起组织坏死，也可侵入血流形成败血症；③分泌物或脓液黏稠，呈乳白色、粉红色、血色或棕黑色，有恶臭，有时有气体产生；④使用氨基糖苷类抗生素（链霉素、卡那霉素、庆大霉素）治疗无效；⑤分泌物直接涂片可见细菌，但普通培养法无细菌生长。
4. 所致疾病
（1） 败血症：
由于抗厌氧菌抗生素的广泛运用，目前败血症中厌氧菌培养阳性率只有5%左右，多数为脆弱类杆菌，其次为消化链球菌。原发病灶约50%来自胃肠道，20%来自女性生殖器。病死率为15%～35%。
（2） 中枢神经系统感染：
最常见的为脑脓肿，主要继发于中耳炎、乳突炎、鼻窦炎等，细菌经邻近部位侵入脑组织，亦可经直接扩散和转移而形成。分离的细菌种类与原发病灶有关，革兰阴性厌氧杆菌最为常见。
（3） 口腔与牙齿感染：
大多起源于牙齿感染，主要包括三大类：牙槽脓肿和下颌骨髓炎；急性坏死性溃疡性齿龈炎（樊尚咽峡炎）和约30%的牙周病。主要由厌氧革兰阴性杆菌引起，核梭杆菌（F.nucleatum）和普雷沃菌素占主导地位。
（4） 呼吸道感染：
厌氧菌可感染上下呼吸道的任何部位，引起扁桃体周围蜂窝织炎、吸入性肺炎、坏死性肺炎、肺脓肿和脓胸等。厌氧菌的肺部感染发生率仅次于肺炎球菌性肺炎。呼吸道感染中分离最多的厌氧菌为普雷沃菌属、坏死梭杆菌（F.Necrophorum）、核梭杆菌、消化链球菌和脆弱类杆菌等。
（5） 腹部和会阴部感染：
胃肠道因手术、创伤、穿孔及其他异常引起的腹膜炎、腹腔脓肿等感染主要与消化道厌氧菌有关。任何引起胃酸产生紊乱的因素均可导致口腔微生物，包括普雷沃属的定植；与阑尾、大肠相关的感染主要由类杆菌，特别是脆弱类杆菌引起。在腹部、会阴部感染中，脆弱类杆菌占病原菌的60%以上。
（6） 女性生殖道感染：
手术或其他并发症引起的女性生殖道一系列严重感染中，如盆腔脓肿、输卵管卵巢脓肿、子宫内膜炎、脓毒性流产等，厌氧菌是主要病原体。分离最常见的厌氧菌为消化链球菌属、普雷沃菌属和紫单胞菌等。因阻塞引起的泌尿道感染亦以厌氧菌为主。
（7） 其他：
无芽孢厌氧菌还可引起皮肤和软组织感染、心内膜炎等。
（三）微生物学检查
1. 标本采取
无芽孢厌氧菌大多是人体正常菌群，标本应从感染中心处采取并注意避免正常菌群的污染，严格无菌操作。最可靠的标本是切取或活检得到的组织标本，从感染深部吸取的渗出物或脓汁也可。厌氧菌大多对氧敏感，标本采取后应立即放入厌氧标本瓶中并迅速送检。
2. 直接涂片镜检
脓汁标本可直接涂片染色后观察细菌的形态特征、染色性及菌量多少，供初步判断结果时参考。
3. 分离培养与鉴定
这是证实无芽孢厌氧菌感染的关键步骤。标本应立即接种到营养丰富、新鲜，含有还原剂的培养基或特殊培养基、选择培养基中，最常用的培养基是牛心脑浸液为基础的血平板。接种最好在厌氧环境中进行（如厌氧手套箱等）。接种后置于37℃厌氧培养2～3天，如无菌生长，继续培养至1周。挑取生长菌落接种两只血平板，分别置于有氧和无氧环境中培养来进行耐氧试验，在两种环境中都能生长的是兼性厌氧菌，只能在厌氧环境中生长的才是专性厌氧菌。获得培养后，再经生化反应进行鉴定。
此外，利用气液相色谱检测细菌代谢的终末产物能迅速作出鉴定，需氧菌和兼性厌氧菌只能产生醋酸，若检测出其他短链脂肪酸（如丁酸、丙酸等）则提示为厌氧菌。核酸杂交、PCR等分子生物学方法已可对一些重要的无芽孢厌氧菌作出迅速和特异性诊断。
（四）防治原则
注意清洗伤口，去除坏死组织和异物，维持局部良好的血液循环，预防创面局部出现厌氧微环境。
要正确选用抗菌药物，95%以上临床厌氧菌包括脆弱类杆菌对氯霉素、亚胺培南、哌拉西林、替卡西林、甲硝唑等敏感。万古霉素适用于所有革兰阳性厌氧菌感染；新型喹诺酮类药物对革兰阳性和革兰阴性厌氧菌都有较高的抗菌活性。但越来越多抗性菌株的产生增加了治疗的难度，95%的菌株对青霉素有抗性。如厌氧菌感染中最常见的脆弱类杆菌能产生β-内酰胺酶，可破坏青霉素和头孢菌素。因此，治疗前还应对分离株进行抗生素敏感性测定，正确选用敏感的抗菌药物。