第二节　病原微生物的发现与微生物学的形成

在19世纪中叶以前，每当传染病出现大流行时，人们总把原因归咎于某些特定人物，出现猎巫行为，尤其是将犹太教徒作为代罪羔羊进行迫害的事件频繁发生。或者认为患者是有罪的人，他们之所以生病，是上帝对他们的惩罚。尽管当时对传染病普遍存在这些愚昧的认识，但早在几千年前，有人提出有关存在致病微小生物的观点。公元前一世纪，Varro曾指出，湿地是危险的区域，因为一些肉眼不可见的微小动物在那里繁殖，并进入到空气中，通过嘴进入人体内，引起疾病。中世纪（约公元476年～公元1453年），麻风病盛行。当时人们就知道要远离麻风病患者，离开疫区，隔离严重患者，这说明当时人们就知道麻风病是可以传播的。在19世纪“疾病微生物理论”诞生前，人们主要用瘴气理论（miasma theory）解释疾病传播。瘴气是指有毒的空气。瘴气理论的基础是“自然发生说（Spontaneous Generation）”，认为生物可以从他们所在的物质元素中自然发生，没有上代。虽然列文虎克在1674年在自制的显微镜下观察到了微生物，但由于对微生物进一步研究的条件受到许多限制，微生物可以自然发生的观点反而更活跃，并于18、19世纪达到了顶峰。

意大利医师吉罗拉莫·弗拉卡斯托罗应该是疾病微生物理论的先驱。1546年，他出版了《论传染和传染病》专著，使人们首次从本质上分析传染病的发生。意大利医师弗朗切斯科·雷迪（Francesco Redi，1626—1697） 是第一位利用科学实验挑战自然发生说的科学家。1668年，他利用缸内放置肉片，然后让缸子开放、纱布覆盖或橡胶塞盖紧三种方式。结果发现，仅开放缸子内的肉上以及盖在缸子上的纱布上有蛆形成，并观察到，蛆的形成是与苍蝇接触有关。在此基础上，他进一步证明了腐烂肉内产生的蛆是由苍蝇产的蛋演变来的。正由于他是第一位开展生物学实验的人，被后人誉为实验生物学的创始人。

显微镜是人类最伟大的发明之一。在它发明之前，人类对周围世界的认识仅局限在用肉眼所看到的东西。显微镜的出现让人类观察到肉眼所不能看到的物体，如微生物。从此，人类的视觉开始由宏观深入微观，有能力去发现、探索微生物的世界。因此，显微镜的发明是促进近代微生物学诞生的核心技术支撑。据记载，显微镜是由荷兰人在16世纪末期发明的。发明者是荷兰眼镜商亚斯·詹森和荷兰科学家汉斯·利珀希，他们用两片透镜制作了简易的显微镜，但他们都没有用这些仪器做过任何重要的观察。第一个用显微镜看到微生物的人普遍认为是荷兰科学家安东尼·凡·列文虎克（Anton van Leeuwenhoek，1632—1723），被后人誉为微生物学的早期开拓者。1683年，他利用自制的透镜观察到了许多肉眼所看不见的单细胞生物（图1-2），他把这些生物称为“animalcules”。17世纪，阿塔纳斯·珂雪（Athanasius Kircher，1601—1680），德国耶稣会教士，当时也在显微镜下观察到醋和酸牛奶以及死于瘟疫人的血中都含有微生物（animalcula）。但是，当时普遍认为，这只是偶然发现。人们对于微小生物的认识仍停留在想象中，而不是显微镜下所观察到的。当时显微镜下微生物与疾病的可能联系仍未引起关注。法国医师尼古拉斯·安德里（Nicolas Andry，1658—1742）是第一个利用显微镜开展医学研究的科学家。1700年，他发表一部有关人体内微生物繁殖的专著，他把微生物称为“worms”，认为这些微生物是天花和其他疾病的原因。1720年，植物学家Richard Bradley也从理论上提出，瘟疫是由有毒的昆虫和显微镜下才可见的活生物引起的。

细菌这个名词是1828年最初由德国科学家克丽斯汀·克尔纳·埃伦伯格（Christian Gottfried Ehrenberg，1795—1876）提出的，用来指代某种细菌。这个词来源于希腊语βακτηριον，意为“小棍子”。1866年，德国动物学家海克尔（Ernst Haeckel，1834—1919）建议使用“原生生物”，即包括所有单细胞生物（细菌、藻类、真菌和原生动物）。1878年，法国外科医生塞迪悦（Charles Emmanuel Sedillot，1804—1883）提出“微生物”概念。

意大利昆虫学家巴希（Agostino Bassi，1773—1856），1807年开始研究使意大利和法国遭受严重经济损失的家蚕白僵病。25年后证实这种蚕病是由微小的寄生真菌（今称蚕白僵霉，Beauvaria bassiana）所引起，通过接触和污染食物而在蚕间传播。1835年发表了《家蚕白僵病》专著，并在书中指出，许多植物、动物和人类疾病是由动物性或植物性的寄生物所引起的。因此，巴希是第一位证明疾病是由微生物引起的人，他的发现要比巴斯德早10年。

路易·巴斯德（Louis Pasteur，1822—1895）虽然不是细菌的最早发现者，但现代人们一致认为他是现代细菌学的奠基人。1860～1864年期间，他开展了有关微生物与疾病间关系的正式实验研究。他揭示了产褥热的病理学，发现了血液中存在化脓性弧菌，提出了利用硼酸杀灭这些微生物的方法。同时，在此期间，利用科学实验首次推翻了自然发生学说。他选用两种瓶子（曲颈瓶、直颈瓶），分别加入肉汁，用火加热将肉汁及瓶子内微生物杀灭。结果发现，曲颈瓶的肉汁由于不再和空气中的微生物接触，4年后瓶内肉汁仍未腐败，而直颈瓶内的肉汁很快就变坏了，说明世界万物都不是自然会发生的（图1-3）。基于上述大量研究，巴斯德提出了“疾病的微生物理论”，并强调医生要使用消毒法。随着疾病微生物学理论的提出，人们逐步认识到，伤口的腐烂和疾病的传染都与微生物有关。这为后来外科消毒方法的建立与推广奠定了重要的理论基础。约瑟夫·李斯特就是在受到巴斯德的疾病微生物理论的影响下，建立起外科消毒技术的。

巴斯德另一个重要贡献是“巴斯德杀菌法”（高温灭菌法）的发明。在显微镜下观察，他发现未变质的陈年葡萄酒中有一种圆球状的酵母细胞，但当葡萄酒和啤酒变酸后，酒液里则出现了一根根细棍似的乳酸杆菌，为此，他认为可能是这种乳酸杆菌使酒 “变酸”的原因。于是，他把封闭的酒瓶泡在水里加热到不同的温度，试图杀死这种乳酸杆菌，又不把葡萄酒煮坏，经过反复多次试验，他发现把酒放在摄氏五六十度的环境里，保持半小时，就可杀死酒里的乳酸杆菌，这就是著名的“巴氏消毒法”，迄今牛奶消毒仍采用这种办法。此外，巴斯德也是疫苗的创始人。1881年，巴斯德观察到患过某种传染病并得到痊愈的动物以后对该病有免疫力的现象，先后研制出炭疽、鸡霍乱、狂犬病等多种疫苗。正因为巴斯德在微生物学形成中的巨大贡献，被后人誉为近代微生物学的奠基人。

现代微生物学另一位核心奠基人是德国医生和细菌学家罗伯特·科赫（Robert Koch，1843—1910）（图1-4），他堪称是病原细菌学的奠基人和开拓者。1876年，他证明了炭疽杆菌是炭疽病的病因，为此，在世界上他第一次证明了一种特定的微生物引起一种特定疾病的原因，并提出了特定传染病由特定病原菌引起的观点，纠正了当时认为所有细菌都是一个种的观点，从而兴起了病原微生物学研究。1881年他创立了两个重要的细菌学技术。一是固体培养基划线分离纯种法。这种方法解决了用液体培养基培养细菌时各种细菌混合生长在一起难以分离的问题。在固体培养基表面，一个孤立的细菌固定地在培养基的某一点上生长，不断地分裂，形成一个个可见的菌斑，这些菌斑很方便地移种到其他的培养基上或接种到动物体内。二是发明了用苯胺对细菌进行染色的细菌染色法。该方法可以清晰地观察细菌的形态，同时他还发明了带照相机的显微镜，能够直接拍摄所看到的细菌。

通过一系列的研究，科赫提出了一个确定病原菌的重要准则——科赫法则（即细菌学三定律）：第一，这种微生物必须能够在患病动物组织内找到，而未患病的动物体内则找不到；第二，从患病动物体内分离的这种微生物能够在体外被纯化和培养；第三，经培养的微生物被转移至健康动物后，动物将表现出感染的征象。受感染的健康动物体内同样能分离出这种微生物。2003年，冠状病毒确定为SARS的病原体就是采用“科赫法则”。

利用这些定理和技术，科赫分离出了许多种疾病的致病菌，如炭疽杆菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌等。其最突出的发现及将他推向事业顶峰的应该是他在1882年成功地分离出的结核病致病菌—结核分枝杆菌。1882年3月24日，科赫在德国柏林生理学会上报告了他这一结果。同时建立了培养结核分枝杆菌的方法（采用凝固的血清上接种培养）。1890年，他培养出结核菌素，并用来诊断和治疗结核病。1905年他因研究结核病，发现结核分枝杆菌与结核菌素而荣获诺贝尔生理学或医学奖。世界卫生组织也于1982年宣布，将每年的3月24日定为世界防治结核病日。1891～1899年，他先后还在埃及﹑印度等地研究了鼠疫﹑疟疾﹑回归热﹑锥虫病和非洲海岸病等，提出了预防霍乱流行和控制疟疾的新方法。此外，科赫还是世界上第一个发明蒸汽杀菌法的人。正是由于科赫为人类征服结核、炭疽、霍乱、鼠疫等危害极大的传染性疾病做出了不可磨灭的功勋，被人们誉为“瘟疫的克星”。他一生的工作奠定了医用细菌学的基础。自巴斯德、科赫发现细菌以后，各种致病细菌相继被发现，19世纪最后30年是细菌学年代，绝大多数致病细菌是在这一时期被发现的。

19世纪80年代促进微生物学发展的另一个重要进展是细菌的革兰染色技术。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，在显微镜下仍然是极难观察。革兰染色技术是1884年由丹麦医师汉斯·克里斯蒂安·革兰（Hans Christian Gram，1853—1938）创立的。该技术与显微镜结合，不仅可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而且还可以对细菌进行分类鉴定。最初该方法是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。

此外，德国生物学家费迪南·尤利乌斯·柯恩（Ferdinand Julius Cohn，1828—1898） 应该也是现代细菌学和微生物学的创始人之一。他基于细菌的形状，把细菌分为四种（球形、短杆、螺纹、螺旋），这种分类方法至今仍然沿用。此外，他是第一个发现杆菌暴露在不利于其生存的环境时，它们能从杆菌状态演变为内生孢子状态，增强细菌抵抗的能力。普通的巴斯德消毒法无法杀灭芽孢，通常要使用高压灭菌法杀灭芽孢。

19世纪最后十年，在微生物学研究上还有两个尤为重要的进展，分别为细菌毒素的致病作用和病毒的发现。法国细菌学家彼埃尔·保罗·埃米尔·鲁克斯（Pierre Paul Émile Roux）和亚历山大·耶尔辛（Alexandre Yersin）于1891年提出并证实白喉杆菌致病不是细菌本身，而是由细菌产生的毒素所引起的。1890年，德国医学家埃米尔·阿道夫·冯·贝林（Emil Adolf von Behring，1854—1917）和日本医学家北里柴三郎（Kitasato Shibasaburō，1852—1931）在罗伯特·科赫领导的柏林传染病研究所合作研究破伤风和白喉抗毒素，他们发现，细菌毒素进入体内后，循环内产生可以中和毒素的物质。随后通过间歇性注射毒素，可从动物血中获得抗毒素血清，应用于临床，疗效显著。1901年，贝林因研究白喉血清疗法而获得首届诺贝尔生理学或医学奖（图1-5）。德国科学家保罗·埃尔利希（Paul Ehrlich，1854—1915）把这种利用抗血清治疗疾病的方法称为被动免疫法（passive immunization），将利用减毒的病原菌或毒素直接接种到人体产生保护抗体的方法，称之为主动免疫法（active immunization）。埃尔利希于1890年起也任职于科赫领导的传染病研究所，他的重要贡献是建立了白细胞分类法、发明结核菌的抗酸染色、研究动物血清的溶血反应等。1908年，他与俄国免疫学家梅契尼科夫（发现吞噬细胞，建立细胞免疫学说）共获诺贝尔生理学或医学奖。

在19世纪后期，随着显微镜的发展和细菌染色技术不断完善，引起疾病的大多数病原微生物都已被发现，但一些疾病的微生物，如天花、狂犬病等，仍不能用显微镜观察到。鲁克斯曾提出，可能存在一些更小的微生物，它们能通过最小孔径的滤膜。当时把这种能被滤过的极小生物称作为“微子”，即病毒的初期概念。1892年，俄罗斯生物学家迪米特里·伊奥尔斯沃维奇·伊凡诺夫斯基（Dmitri Iosifovich Ivanovsky，1864—1920）在研究烟草花叶病时，发现将用细菌过滤器处理过的、有病的烟叶滤汁擦在无病的烟叶上，能使生长正常的叶子生病。为此，他认为一定有一种更小的能通过细菌过滤器的微生物存在。1898年，荷兰微生物学家马丁努斯·拜耶林克（Martinus Beljerinck，1851—1931）重复证明了该项发现。并确信在通过过滤器的溶液中有一种新的、具有传染性的物质，他把这种比细菌更小的微生物命名为“病毒”，即有毒的意思。因为病毒实在太渺小了，即使普通光学显微镜放大一千倍以上也难以看到。直到1937年由多伦多大学研制的可放大七千倍的电子显微镜问世，人们清楚地看到了病毒。在伊凡诺夫斯基的启发下，自1930年以来许多医生和兽医在研究某些人和动物疾病时，也发现一些经过过滤器除去了细菌的液体也会使人和动物生病，从而相继发现了许多可致人类及动物疾病的病毒。如流行性感冒病毒、麻疹病毒、乙脑病毒、肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）病毒等。据现有资料证明，人类的传染病约有80%是由病毒所致。它是对人类危害最大、个头最小的“杀手”。进入20世纪后，人们又发现了一些大小介于细菌和病毒之间的微生物。1905年，德国科学家埃里克·霍夫曼（：Erich Hoffmann）和弗里兹·萧丁（Fritz Richard Schaudinn）在梅毒性下疳的分泌物中发现了梅毒螺旋体（spirochete）。1909年，美国病理学家霍华德·泰勒·立克次（Howard Taylor Ricketts，1871—1910）发现了立克次氏体（Rickettsia）。1934年，我国科学工作者谢少文首先应用鸡胚培养立克次体成功，为人类认识立克次体做出了重大的贡献。1935年宫川米次等从腹股沟淋巴肉芽肿患者的染色体中发现了衣原体（Chlamydia），曾被命名为宫川氏体（Miyagawanella）。1957年我国科学家汤飞凡、张晓楼等成功分离出沙眼衣原体。

虽然伤口或手术部位一直是人们关注的主要感染部位，但随着微生物学的诞生，人们也注意到了人体肠道内也存在大量微生物，现统称为肠道菌群。据推测，一个正常成人体内，肠道内细菌总重量可达1～1.5千克，细菌数量可达到1014个，是人体细胞总数的10倍。人体肠道内细菌种类约为500～1000种，其中30～40种细菌占细菌总数的99%以上，是肠道优势细菌根据其在肠道内不同的生理功能可被分为共生菌和条件致病菌。共生菌是指与我们人体是互利共生的细菌，即人体为细菌的生活提供生存场所和营养，而这些细菌则为人体产生有益的物质和保护人类健康。这些细菌主要为双歧杆菌、乳酸菌、拟杆菌等，它们占据了肠道菌群所有细菌数量的99%以上，是肠道菌群的主体。条件致病菌在肠道菌群内数量较少。在正常条件下，由于大量共生菌的存在，这些细菌并不容易繁殖，对人体造成危害。肠道内常见的条件致病菌大多是肠球菌、肠杆菌等。早在19世纪末，人们就关注到肠道菌群失调（enteric dysbacteriosis）与腹泻的关系，这个发现也是当时人们对“一菌一病”微生物学理论认识的突破。进入到20世纪80年代，人们进一步发现肠道是创伤、烧伤、大手术等各类危重症患者发生感染的病原菌的重要来源。这可能是临床上许多危重症患者无明显感染灶却发生全身感染/脓毒症的重要原因。这种肠道内细菌及其毒素通过肠道黏膜屏障侵入到肠外组织的过程称为细菌移位（bacterial translocation），由肠道细菌移位所引起的感染称为肠源性感染（gut derived infection）。基于肠道是体内最大的潜在感染灶，有人甚至认为，肠道是多器官功能障碍发生的“始动器官”。20世纪90年代，泌尿生殖道感染（urogenital tract infections）也开始受到重视。